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干貨分享：多肽類藥物雜質的鑒定，提高雜質鑒定的通量和準確度

根據美國藥典（USP）多肽藥物指在不考慮工藝的條件下，氨基酸數目≤40屬于多肽藥物；當采用化學合成方法制備時，其多肽藥物指氨基酸數目<100。

多肽類藥物的制備目前主要有化學合成、基因重組和從動植物中提取三種方法。其中固相多肽合成技術的產生極大推動了多肽藥物的發展，本篇主要利用雙三元液相與Orbitrap高分辨率質譜聯用技術，鑒定了多肽類藥物胸腺法新的相關降解雜質。

背 景

胸腺法新是由28個氨基酸組成的多肽，相對分子質量3108.28。注射用胸腺法新是胸腺法新加適量賦形劑制成的無菌凍干粉針，主要用于治療慢性乙肝、丙肝，也可與其他藥物聯用治療腫瘤、免疫缺陷等疾病。目前胸腺法新的合成方法主要為固相多肽法，合成步驟煩瑣，易產生與胸腺法新結構類似的雜質[1]。

雜質的類型主要分為兩類，一類為固相合成工藝相關的雜質，如氨基酸的去除、插入、氧化以及殘留溶劑、試劑、無機雜質等。另一類來源多肽的降解，如通過β-消除反應、焦谷氨酸和琥珀酰亞胺的形成。通過對雜質的深入分析可以指導工藝的改進并保證用藥的安全性。當相關的雜質高于0.1%時需要體現，高于0.5%時需要進行鑒定，高于1%時則需要精確定量，總雜質的含量要小于5%[2]。

2015版中國藥典采用LC-UV主成分自身對照法對單個雜質和雜質總量進行了規定，但標準方法中流動相為硫酸銨緩沖液-乙腈系統由于緩沖液與質譜不兼容，因此當進行雜質鑒定時，傳統方法需對目標雜質峰進行收集、富集、除鹽、旋干再鑒定，過程繁瑣、且增加了雜質成分降解等不確定影響因素。

方 案 特 點

利用賽默飛特色的雙三元液相色譜多組分中心切割二維在線除鹽方法，可實現一次進樣即可完成多組分除鹽的目的，電霧式檢測器（CAD）作為一種通用型檢測器可輔助建立除鹽方法，評價除鹽效果。

在確定了二維除鹽條件后，利用Orbitrap高分辨質譜的高分辨率、出色的靈敏度、高質量精度等優勢性能，對已在線脫鹽的未知雜質組分進行精確的鑒定。大大的提升了樣品的穩定性和分析效率（全自動在線多組分切割2DLC系統設計如下圖）。

全自動在線多中心切割2DLC在線除鹽系統流路示意圖（點擊查看大圖）

實 驗 方 法

液相方法

第一維液相方法同2015版藥典，各雜質分離良好，其中面積歸一化含量在0.1%以上的雜質共為11個，因此本實驗主要對11個雜質進行定性鑒別。第二維除鹽過程采用AcclaimC18（300?），乙腈-0.1%甲酸作為流動相進行梯度分析，輔以CAD檢測，確定了二維的最佳除鹽和分離條件。

樣品在一維標準方法下的分離譜圖（上圖）及主要目標雜質被切割至第二維在線脫鹽后的典型總離子流圖（點擊查看大圖）

質譜方法

一級全掃描：分辨率70,000;掃描范圍:300-1700m/z;

二級為數據依賴型掃描模式，分辨率35,000;歸一化碎裂能量（SteppedNCE）：20,23,26;動態排除10s

數據處理

使用Thermo Scientific? BioPharmaFinder軟件，根據胸腺法新的氨基酸序列進行相關雜質的鑒定。由于高分辨質譜的高專屬性和高靈敏度的特性，因此每個雜質組分中會鑒定到多種成分。氨基酸序列性質相似時，其離子化效率接近，根據其質譜中的相對豐度可對每個組分中的每一成分進行初步的相對定量（注：主成分切到質譜中進行鑒定只是少部分）。1-6雜質組分的鑒定結果下圖，7-11組分的鑒定結果如圖3B，每一成分的一級質量偏差均小于2ppm。

雜質組分1-6的鑒定結果（圖上數字代表該成分的保留時間）（點擊查看大圖）

雜質組分7-11的鑒定結果（點擊查看大圖）

小 結

傳統在線除鹽方法多采用1個或2個loop環進行目標物收集，但當樣品雜質較多，且標準方法分析時間較長時（本實驗樣品分析時間為60min），將極大的影響雜質的分析效率，而手工收集也可能會引入其他降解產物的產生。

采用6個loop環的多中心切割方法，一次進樣可完成多目標雜質的在線除鹽，顯著的提高鑒定的通量，同時與Orbitrap高分辨質譜聯用，強強聯合，提高雜質鑒定的通量和準確度，為后續的實驗提供有力的數據支撐。

參 考 文 獻

[1]程磊,唐洋明,殷果,等.HPLC法對胸腺法新及其制劑中雜質檢查[J].藥物分析雜志,2013(11):1942-1947.

[2]D’hondt,Matthias,etal."Relatedimpuritiesinpeptidemedicines."Journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis101(2014):2-30.

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